酶聯(lián)免疫試劑盒的底物A就是顯色劑A(含過氧化氫)為供氫體(DH2),底物B就是顯色劑B(含TMB),用于顯色。
另外,常用的底物還有:
1)AP的底物,常用的為對-硝基苯磷酸脂(PNP),其反應物為的對硝基酚,測讀波長為405nm2)GOD的底物,為葡萄糖,供氫體為對硝基藍四氮唑,反應產(chǎn)物為不溶性的藍色沉淀 什么是TMB?TMB即四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)是一種脂溶性較強的基團,因此容易進入細胞與細胞器中的HRP反應,且由于這種高度的脂溶性,使其易形成多聚體,在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深蘭色沉淀物,這使得TMB成為組化實驗中的一種很好的發(fā)色團。同時反應產(chǎn)物的沉淀,使得HRP的活性部位更加暴露,利于酶氧化反應進行。
酶聯(lián)免疫試劑盒TMB的反應產(chǎn)物為深藍色,利于光鏡觀察,且反應產(chǎn)物越聚越大,常超出單個細胞器的范圍(而DAB則被限制在其內(nèi)),故TMB反應的檢測閾較低。
由于上述優(yōu)點,目前TMB常用于光鏡及超微結(jié)構(gòu)水平的HRP及HRP-WGA神經(jīng)投射的研究。
需要注意的是:TMB顯色液中的A液和B液應在2h內(nèi)新鮮配制。另外,TMB是一種較強的皮膚刺激劑,并有致癌的潛在可能,故使用時應帶手套及在通風條件下操作。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色,目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定,可配成溶液試劑,只需與H2O2溶液混和即成應用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有無致癌性等優(yōu)點,因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后,TMB產(chǎn)物由藍色呈,可在比色計中定量,zui適吸收波長為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感,但空白值極低,也為一些酶聯(lián)免疫試劑盒所采用。
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